Vetőmagok esetén a csírázóképesség a legfőbb minőségi mutató, azonban a cukkinivetőmagokat virológiai vizsgálatnak is alávetettük. Lássuk, miért fontos, és hogyan zajlik a vizsgálat!
A cukkininek számos olyan vírusbetegsége van, amelyek maggal is terjedhetnek, de ezek egyike sincs karantén vagy vizsgálatköteles nem-karantén listán a hazai és az EU előírás szerint. Más országok, nemzetközi szervezetek szabályozásukban azonban előírhatják a „mentesség” igazolását, és a hazai termelők, forgalmazók is kérhetnek ellenőrzést gyanú esetén. Vizsgálatainkat a megrendelők által kért vírusbetegségek kimutatására végezzük.
Leggyakrabban az uborka mozaik vírus (CMV), a tök mozaik vírus (SqMV), a görögdinnye mozaik vírus (WMV) és a cukkini sárga mozaik vírus (ZYMV) vizsgálatát kérik a termelők értékesítési szándékaiknak megfelelően. Mivel ezek a vírusok más-más módon (magfelületen ill. valódi magátvitellel) és arányban fordulhatnak elő a magtételekben, ezért a vizsgálat is összetett: vizuális és laboratóriumi.
- A magtételek vírusvizsgálatánál 100 db magot elvetünk, majd a kikelő növényeken figyeljük a fertőzöttségre utaló tünetek megjelenését.
- A gyanús egyedekről, de minimum 10 növényről levélmintát szedünk és 80 magmintával együtt szerológiailag megvizsgáljuk ELISA módszerrel.
- A magminta előkészítéséhez 2 db vetőmagot (kb. 0,1 g) 2 ml pufferben orsós csíraprés segítségével homogenizálunk. A lomblevéllel rendelkező csíranövénnyel hasonlóan járunk el a présnedv kialakításakor „az egy növény egy minta” elv figyelembevételével.
Az ELISA vizsgálat az EPPO PM 7/125 standard és a diagnosztikum gyártó utasításai szerint történik.
Az enzimhez kapcsolt ellenanyag vizsgálatok (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay=ELISA) olyan szilárd fázison lejátszódó színreakciók, ahol a reagensek műanyag felülethez vannak kötve, és a reakciót enzimmel kapcsolt antitest segítségével követjük nyomon.
A vizsgálatokhoz mikrotitráló lapokat, úgynevezett ELISA lemezeket használunk, amelyek polisztirolból készülnek és általában 8 × 12 = 96 db 300 μl-es bemélyedéssel rendelkeznek. Annyi lemezre van szükség, ahány vírusra történik a vizsgálat.
- A növényi nedv ülepítése után az alábbi ábrán látható dupla ellenanyag szendvics ELISA módszer szerint járunk el.
Az ELISA vizsgálat folyamata
- Érzékenyítés:
– Érzékenyítő pufferben 1/1000 arányban hígított, vírus specifikus IgG-t adagolunk az ELISA lemez mélyedéseibe 100 µl/mélyedés mennyiségben.
– A lezárt, nedves dobozban elhelyezett ELISA lemezt +30°C-on 4 órát inkubáljuk.
– Az inkubáció végén az ELISA lemez tartalmát PBS-Tween mosópufferrel kimossuk.
- Növényi minta adagolása:
– A homogenizált présnedvet felvisszük az érzékenyített ELISA lemezre 100 µl/lyuk mennyiségben.
– Minden ELISA lemezre 1 mélyedésbe pozitív kontrollt, 1 mélyedésbe negatív kontrollt és 4 mélyedésbe vak kontrollt (mosópuffert) adagolunk.
– A lezárt, nedves dobozban elhelyezett ELISA lemezt +4°C hőmérsékleten, 1 éjszakán át inkubáljuk.
– Ezt követően az ELISA lemez tartalmát PBS-Tween mosópufferrel kimossuk.
- Konjugátum adagolása:
– Konjugátum pufferben 1/1000 arányban hígított, alkalikus foszfatáz enzimmel konjugált vírus specifikus IgG-t adagolunk az ELISA lemezre 100 µl/mélyedés mennyiségben.
– A lezárt, nedves dobozban elhelyezett ELISA lemezt +30°C-on 5 órát inkubáljuk.
– Majd az ELISA lemez tartalmát PBS-Tween mosópufferrel kimossuk.
- Szubsztrát adagolása:
– Dietanolamin szubsztrát pufferben 1 mg/ml arányban oldott para-nitrofenil foszfát di-Na-sót adagolunk az ELISA lemezre 100 µl/mélyedés mennyiségben.
– Az inkubálás 1-2 órán keresztül, 20-25 °C-on, sötét, nedves dobozban történik.
- Fotometrálás:
– Az eredményeket ELISA plate reader használatával 405 nm hullámhosszon mérjük ki.
– A kiértékelés excel táblázatban történik, az adatok emelkedő sorrendbe helyezése után a következő képlettel: Kritikus határ = (kiemelkedő OD értékig (ugrás) vett minták átlaga + 3 x kiemelkedő OD értékig vett minták szórása) x 1,1
– A vizsgálat eredménye negatív, ha a minta OD értéke alacsonyabb, mint a kritikus határ.
– A vizsgálat eredménye pozitív, ha a minta OD értéke magasabb vagy egyenlő a kritikus határ értékével.
Forrás: EPPO PM 7/125 standard, Bioreba ELISA test procedure Version: 5 – 20.06.2021.