A kutyáknak szánt takarmányok összetételének ellenőrzése a kutyák egészsége, a termékminőség és a piaci átláthatóság szempontjából is érdekes lehet. A kutyák egészsége nagymértékben függ a fehérjeforrások minőségétől, azonban egyes húsféleségek allergiát okozhatnak az arra érzékeny kutyáknál. A kutyaszalámik terméktesztjén a laboratóriumi szakemberek PCR vizsgálattal ellenőrizték, hogy a termékek tartalmazzák-e a csomagoláson feltüntetett állatfajokat. Lássuk, hogyan zajlott vizsgálat!
A vizsgálat célja annak megállapítása volt, hogy a mintákból kivont nukleinsav tartalmazza-e a termékek csomagolásán feltüntetett fajból származó összetevők DNS-ét. Ennek elérésére polimeráz láncreakciót (PCR) alkalmaztunk, melyet az adott faj egy-egy DNS-szakaszának kimutatására terveztek. A vizsgálat során szarvasmarha, juh, kecske, csirke, pulyka, lúd, sertés és ló adott DNS-szakaszára specifikus reakciókat végeztünk. A vizsgálat az élelmiszerekben és takarmányokban található állatfajok azonosítását célzó, MSZ ISO/TS 20224 szabványsorozaton alapul, melyek az adott fajra specifikus, a genetikai állományban (genomban) jelenlévő DNS-szakasz kimutatására épülnek. A kimutatási határ mindegyik esetben 5 kópia. Ló DNS kimutatása EURL AP protokoll alapján történik, ennél a kimutatási határ 0,5%.
A módszer lépései:
- Elsőként a mintából 2 gramm mennyiséget kimérünk, több különböző ponton megbontva a kutyaszalámit, hogy reprezentatív mintát kapjunk.
- Ezután a kimért mintából DNS-t nyerünk ki olyan módszerrel, mely az erősen feldolgozott élelmiszerekből, takarmányokból való DNS-kivonásra alkalmas. Az izolálás (elkülönítés) első lépése a sejtek feltárása, ami egy proteináz K nevű fehérjebontó enzimmel történik. Ezt követően egy több lépcsőből álló tisztítási folyamat során leválasztjuk azokat a molekulákat, melyek a polimeráz láncreakciót gátolhatják, így egyre tisztább DNS-t kapunk. Az oldataink tisztaságának ellenőrzése végett egy ún. negatív extrakciós kontrollt, egy tisztsági próbamintát készítünk vízzel, mely a valódi mintához hasonlóan végigmegy a DNS-kinyerési folyamaton.
- A kivont DNS mennyiségét és minőségét spektrofotométerrel ellenőrizzük.
- Ha megfelelőnek bizonyul, akkor összemérjük az egyes fajok kimutatását célzó PCR-ekhez szükséges reakcióelegyeket. Ennek egyik legfontosabb összetevője a DNS-polimeráz, amellyel a keresett DNS-szakaszt „felszaporítjuk”, hogy könnyen kimutatható legyen. Ezenkívül szükségesek még a felszaporítandó szakasz határait kijelölő, a szakaszra specifikus bázissorrendű primerek (DNS-darabok). Mivel a szóban forgó reakciók valós idejű, azaz real-time PCR-ek, a mintához egy fényjelzéssel ellátott DNS-darabot, úgynevezett próbát adunk. Ennek a fénykibocsátását mérve tudjuk követni, hogyan halad a reakció. Az enzim működéséhez megfelelő körülményeket (pl. pH, ionösszetétel) speciális puffer oldat biztosítja, mely tartalmazza a DNS építőköveit, a nukleotidokat is.
- A mixet 20 mikroliterenként kiadagoljuk PCR-csövekbe, majd ezekhez 5-5 mikrolitert mérünk hozzá a minták DNS-kivonatából, valamint a negatív extrakciós kontrollból. Egy csőbe minta helyett vizet teszünk, ez lesz a negatív PCR-kontroll, amivel a PCR-reagenseink tisztaságát ellenőrizzük. A reakció megfelelő lefolyását pedig pozitív PCR-kontrollal ellenőrizzük.
- Ezután a csöveket a PCR-készülékbe tesszük. A gép megfelelő ideig különböző hőmérsékleteken inkubálja a mintákat, mellyel a PCR lezajlásához szükséges körülményeket biztosítja. Ez a folyamat ciklikusan ismétlődik, a DNS mennyisége pedig minden ciklusban megkétszereződik. Ezt a fluoreszcens festék jele alapján tudjuk követni, amit a PCR készülék mér és ezzel egyidejűleg egy jellegzetes lefutású görbét is rajzol. Minél nagyobb mennyiségben van jelen a mintában az adott faj, annál korábbi ciklusnál indul a görbe. Amennyiben a minta nem tartalmazza az adott faj DNS-ét, a PCR negatív lesz, görbe helyett csak vízszintes vonalat kapunk.
- Az alkalmazott ISO szabvány sorozat előnye, hogy a különböző állatfajok kimutatására tervezett PCR-ek mind összetétel, mind protokoll tekintetében össze vannak hangolva, így egyszerre több faj is vizsgálható. Ehhez ún. multiplex PCR-t futtatunk, ami azt jelenti, hogy a reakcióelegy több faj specifikus primereit és próbáját tartalmazza. Ebben az esetben a különböző próbák különböző „színű” (különböző hullámhosszon fluoreszkáló) festékkel vannak jelölve, így mennyiségük változása a készülék különböző csatornáin detektálható. A kapott pozitív PCR eredményekből megállapítható, hogy mely fajok DNS-ét tartalmazta a minta.